In de medische en biologische onderzoekswereld speuren wetenschappers continu naar betrouwbare en reproduceerbare methoden voor de isolatie en opslag van biologische monsters. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) vormen een kernbestanddeel in deze context. Deze cellen – waaronder lymfocyten, monocyten en dendritische cellen – zijn essentieel voor onderzoek gericht op het immuunsysteem en zijn toepassing gaat van fundamentele immunologische studies tot klinische toepassingen zoals RNA-sequencing en flowcytometrie.
Het protocol dat in de gegeven bronnen beschreven wordt, biedt een stapsgewijze, toegankelijke aanpak voor de verzameling, isolatie en cryopreservatie van PBMC’s, evenals EDTA-plasma en buffy coat. Het accent ligt op het behouden van hoge levensvatbaarheid van de cellen, wat cruciaal is voor nauwkeurige en betrouwbare downstream-analyse. In deze artikel geven we een gedetailleerde uitleg van het protocol, het gebruikte materiaal en de technische stappen. We beoordelen ook de betrouwbaarheid van de informatie en de relevantie voor praktische toepassingen in medisch en onderzoeksgerelateerde contexten.
Inleiding
Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) zijn immuuncellen afkomstig uit het perifere bloed. Ze worden vaak gebruikt in onderzoek naar de rol van het immuunsysteem in diverse biologische processen, zoals immuunergering, kankerimmuniteit en infectieziekten. Het protocol dat hier besproken wordt, richt zich op het efficiënt en veilig isoleren en opslaan van deze cellen uit volbloed, met als doel de levensvatbaarheid en functionaliteit van de cellen in downstream-toepassingen te maximaliseren.
Het beschreven protocol is ontworpen voor gebruik in laboratoria en klinische instellingen, waar het verzamelen en opslaan van biologische monsters onder steriele en consistente omstandigheden essentieel is. De aandacht voor de handhaving van een hoge levensvatbaarheid – zoals gemeten via flowcytometrie en trypanblauw-uitsluiting – benadrukt de kritische aard van cellenkwaliteit in immunologisch onderzoek.
De gegeven informatie is afkomstig uit een onderwijsvideo en het daarbij behorende schriftelijke protocol, die samen een compleet overzicht geven van de technische stappen en benodigde materialen. De focus ligt op het gebruik van centrifugatie, oplossingen zoals DMSO voor cryopreservatie, en de opslag van monsters bij lage temperaturen (−80 °C of vloeibare stikstof).
Het protocol in stappen: Verzameling, isolatie en cryopreservatie van PBMC’s
Verzameling van bloedmonsters
Het protocol begint met de verzameling van volbloed via de standaard aderlatingstechniek. Voor de isolatie van PBMC’s worden zes dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuisjes en één EDTA-buisje gebruikt. De EDTA-buis zorgt voor anticoagulatie van het bloed om stolling te voorkomen tijdens de verdere verwerking.
Na verzameling kunnen de buisjes maximaal vier uur opgeslagen worden, zolang ze op kamertemperatuur bewaard worden. Dit geeft flexibiliteit in de timing van de verdere stappen, maar vereist wel zorgvuldige planning om verontreiniging of cellenschade te voorkomen.
Centrifugatie en laagseparatie
Na verzameling worden alle buisjes op 1800g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur centrifugeerd. Tijdens deze stap vormt zich een dichtheidsgradiënt in de buisjes, wat leidt tot de afzondering van verschillende bloedbestanddelen:
- Plasma en PBMC’s bevinden zich boven het dichtheidsgradiëntmedium.
- Erytrocyten en granulocyten zinken naar de bodem van de buis.
- Buffy coat, een laag rijke in mononucleaire cellen, is visueel zichtbaar boven het dichtheidsgradiëntmedium.
De precisie van deze laagseparatie is van groot belang voor het succes van het protocol. De gegeven informatie geeft aan dat elk dichtheidsgradiëntbuisje ongeveer 12 miljoen PBMC’s oplevert, maar benadrukt ook dat het absolute aantal cellen kan variëren afhankelijk van patiëntspecifieke omstandigheden.
Verwerking van de buffy coat en plasma
De buffy coat wordt voorzichtig afgestreken en overgebracht naar een cryoflacon voor cryopreservatie. Het is belangrijk om verontreiniging door plasma of erytrocyten te voorkomen, aangezien dit de kwaliteit van de cellen kan beïnvloeden.
Het EDTA-plasma wordt eveneens verzameld en kan apart gebruikt worden voor andere analyses. De gegeven informatie benadrukt dat het plasma en de buffy coat na verzameling opgeslagen kunnen worden in een vriezer bij −80 °C, of in vloeibare stikstof voor langdurige bewaring. De keuze van opslagmethode hangt af van de tijdsplanning en de eisen van de downstream-toepassing.
Cryopreservatie van PBMC’s
De cryopreservatie is een kritische stap om de levensvatbaarheid en functionaliteit van de cellen over een langere periode te bewaren. Het protocol gebruikt DMSO (dimethylsulfoxide) als cryoprotectieve stof. DMSO vormt een essentieel onderdeel van de cryopreservatieoplossing en moet nauwkeurig toegevoegd worden om schade aan de cellen te voorkomen.
Voorbereiding en toevoeging van DMSO
Voor de cryopreservatie wordt de PBMC-pellet voorzichtig opnieuw gesuspenderd in oplossing 2. Vervolgens wordt oplossing 3, die DMSO bevat, druppelsgewijs toegevoegd. Het is belangrijk dat oplossing 3 pas wordt toegevoegd als deze direct verwerkt kan worden, aangezien DMSO bij kamertemperatuur giftig is voor cellen.
Nadat de oplossingen zijn gemengd, wordt de celverdeling in cryoflacons aangebracht. Deze worden opgeslagen in een voorgekoelde vriezercontainer en na 12 uur overgebracht naar een vriezer bij −80 °C. Voor langdurige opslag kan ook vloeibare stikstof gebruikt worden.
Ondooien en verdere verwerking
Voor het ontdooien van cryopreserveerde PBMC’s worden de cryoflacons met droogijs overgebracht naar een incubator van 37 °C. Het ontdooien duurt ongeveer vier minuten, waarna het supernatans – inclusief DMSO – verwijderd wordt. De celpellet wordt opnieuw gesuspenderd in een geschikt medium voor downstream-toepassingen zoals celkweek of flowcytometrie.
Na het ontdooien wordt de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld. In de gegeven bronnen wordt gemeld dat de levensvatbaarheid van PBMC’s, monocyten en lymfocyten gemiddeld 94 ± 4%, 98 ± 1,1% en 93 ± 5,6% bedraagt, respectievelijk. Met trypanblauw-uitsluiting als alternatieve methode ligt de levensvatbaarheid op 88 ± 7,5%. Deze hoge levensvatbaarheid benadrukt de betrouwbaarheid van het protocol.
Betrouwbaarheid en toepassing van het protocol
Het protocol is duidelijk en stapsgewijs opgebouwd, wat het geschikt maakt voor zowel zelfstudie als klinische toepassing. De gebruikte technieken – zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie, DMSO-cryopreservatie en flowcytometrie – zijn standaard in immunologisch laboratoriumonderzoek en worden hier beschreven met een aandacht voor technische precisie en veiligheid.
De gegevens over levensvatbaarheid zijn afkomstig uit een analyse van 56 monsters, wat een betrouwbare statistische basis vormt voor de conclusies. De auteur van het protocol ([email protected]) is verantwoordelijk voor de inhoud, en de informatie is opgenomen in een educatief videoverwijzing via Jove.com. Deze bron is betrouwbaar binnen het wetenschappelijke en onderwijsomgeving, aangezien Jove.com een platform is dat wetenschappelijke protocollen en demonstraties publiceert.
Hoewel het protocol primair gericht is op medisch en wetenschappelijk onderzoek, kunnen de technieken en principes ook relevant zijn voor andere sectoren waar biologische monsters en cellen onder controle moeten worden gehouden, zoals farmacie, biotechnologie en medische diagnostiek.
Conclusie
Het protocol voor de isolatie en cryopreservatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) biedt een duidelijke, reproduceerbare aanpak voor het verzamelen, behandelen en opslaan van biologische monsters met hoge kwaliteit en levensvatbaarheid. Door het gebruik van dichtheidsgradiëntcentrifugatie, DMSO-cryopreservatie en nauwkeurige ontdoostemperaturen, wordt zorg genomen voor de behoud van celintegriteit en functionele eigenschappen. De gegeven levensvatbaarheid van 94% of hoger benadrukt de efficiëntie van het protocol.
Voor zowel onderzoekers als klinische professionals is het belangrijk om dergelijke protocollen nauwkeurig en volgens de beschreven stappen uit te voeren om consistente resultaten te garanderen. De beschikbaarheid van duidelijke instructies, video’s en ondersteunende reagentia helpt bij het implementeren van het protocol in diverse laboratoriumomgevingen.